Станут ли массово доступными «таблетки для генома»? Каковы шансы на полное излечение реципиентов генной терапии и каковы риски фатального повреждения ДНК при таком лечении? Как далеко мы готовы зайти в коррекции «ошибок»? На что делают ставку российские разработчики? О настоящем и будущем медицинской генетики мы поговорили с одним из создателей экспериментального российского генного лекарства против наследственной слепоты, младшим научным сотрудником направления «Генная терапия» университета «Сириус» Андреем Бровиным.

— По всем признакам мы уже стоим на пороге той самой долгожданной научной революции, в которой генная терапия станет привычной частью практической медицины. И все-таки когда это произойдет, какие этапы еще нужно пройти науке?

— Вы правы, сейчас действительно очень активно развиваются прикладные приложения медицинской генетики. Уже совсем скоро ключевому событию в этой области — появлению и началу применения полногеномных секвенаторов — исполнится двадцать лет, за это время было опубликовано огромное количество — 1,8 миллиона — статей, в которых используется этот метод. Часть результатов уже встроена в современную персонифицированную медицину, это касается и полногеномного поиска ассоциаций, и генной терапии, и геномного редактирования. Поэтому правильнее сказать, что мы не одной ногой стоим на пороге, а уже двумя ногами твердо стоим в будущем, которое сейчас активно внедряется и в нашу реальность тоже.

Что же касается настоящих этапов этого пути, то самым проблемным из них я бы назвал не научный, а законодательный, который отдаляет применение препаратов передовой терапии в клинике. Продвигается эта тема только благодаря положению о медицинских исключениях — в частности, в России уже несколько лет применяют технологию генно-клеточной терапии на основе трансплантации костного мозга с помощью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и CAR-T-терапии. Ежегодно такое лечение получают 200 пациентов, однако на данный момент терапия осложнена дефицитом расходных материалов, необходимых для клеточных работ.

— Есть ли вообще определенность — каков простор у науки для манипуляций с человеческой ДНК? Прошло не так много времени с тех пор, когда научное сообщество подвергло остракизму китайского ученого Хэ Цзянькуя за починку человеческих эмбрионов с предрасположенностью к ВИЧ…

— Давайте будем называть вещи своими именами. Не «за починку», а за редактирование человеческих эмбрионов, не «сообщество подвергло остракизму», а он был осужден за преступление против норм морали, биоэтики и человечности. Не считаю этот пример позитивным опытом для современной науки, и по итогу ситуация выглядит как черный пиар. Я считаю намного более интересными и этичными результаты, которые были опубликованы месяц назад в другой работе китайских коллег — о терапии диабета второго типа у пожилого пациента с помощью пересадки части здоровой поджелудочной железы, полученной из стволовых дифференцированных клеток крови того же пациента. Исследование включало в себя все тесты на клетках, на мышах, на обезьянах, методика была полностью проверена и не вызвала побочных эффектов, а точно помогла излечить неизлечимую ранее болезнь.

На текущий момент данная работа является вершиной применения научных разработок в реальной трансляционной медицине. И заметьте, для этого не потребовалось манипуляций с ДНК, работы с CRISPR-Cas-системами, эмбрионами человека, а только пациент и его кровь. Именно такие работы вызывают настоящее удивление и восторг, а не намеренное шокирующее нарушение норм морали и этики.

Еще раз стоит заострить внимание на том, что манипуляции с человеческой ДНК люди в лабораториях проводят каждый день сотни тысяч раз, делая ПЦР, но никто не должен редактировать эмбрионы человека, пока известны все опасности геномного редактирования.

— Приведите, пожалуйста примеры по основным регионам мира. Что и где сейчас можно, а что нельзя делать ученым в медицинской генетике?

— В нашей стране основным лимитирующим документом является 62-й федеральный закон, который не позволяет использовать фармсубстанции, полученные не на производстве. Тем не менее ex vivo генную терапию по трансплантации костного мозга в рамках медицинских исключений у нас уже проводят, поэтому основной вопрос заключается в производстве и применении фармсубстанций в малых объемах. На данный момент зарегистрирован один препарат генной терапии — Zolgensma, производитель — американская компания AveXis (Novartis). И один находится на стадии клинических испытаний — препарат для лечения гемофилии А производства российской биотехнологической компании «Биокад».

В США стабильно регистрируются препараты генной и клеточной терапии разных наследственных заболеваний, с прошлого года и препараты CRISP-Cas. Суммарно одобрено уже 30 препаратов.

По Китаю мы никогда не узнаем точную информацию, но, похоже, в Китае возможно все, а редактирование эмбрионов и успешная терапия диабета — это лишь вершина айсберга.

Эффективно или безопасно

— Давайте поговорим непосредственно о методах. Самые большие авансы выдают редактору CRISPR-Cas9, так называемым генетическим ножницам (не зря же в 2020 году за эту систему была вручена Нобелевская премия по химии). Почти все научные группы экспериментируют с этой системой. Что показывают эти опыты? Насколько технология готова для редактирования человеческого генома?

— На сегодня CRISPR-Cas9 — это самый эффективный метод исправления генетических мутаций, и за последние два года данная технология вновь набирает обороты, но уже под другим названием — прайм- или бэйс-эдиторы. С 2019 года по настоящее время было разработано уже пять поколений прайм-эдиторов, которые в последней своей модификации способны заменять фрагменты в сто пар оснований, что позволяет одним препаратом полностью устранить причины нескольких синдромов одновременно. Основная сила метода в том, что редактор находит любой запрограммированный с помощью гидовой РНК фрагмент ДНК, вносит разрыв в последовательность, и далее часть ДНК гибридизуется с РНК как затравка для дальнейшего синтеза уже неспаренного фрагмента с помощью специального фермента — обратной транскриптазы. В итоге мы получаем комплементарный фрагмент полностью функциональной молекулы ДНК, который устраняет именно причину генетических заболеваний в виде мутации.

Надо признать, что звучит это невероятно, как фантастика. Однако в реальности мы имеем несколько важных проблем. Основная из них, характерная вообще для генной терапии, — это доставка. Если предыдущие версии CRISPR-Cas9 можно было упаковать в одну ААВ-частицу (аденоассоциированный вирус. — «Монокль»), то комплекс из Cas9 и обратной транскриптазы (что представляет собой прайм-эдитор) уже не помещается в стандартную векторную частицу. Поэтому сейчас активно разрабатываются методы доставки и сборки белков с помощью технологии интеинового транс-сплайсинга, при которой конструкции доставляют по частям на уровне генов с помощью векторов, а собирают на уровне белковых комплексов. С этими методами, в частности, и я работаю в рамках свой диссертации. Надеюсь, что скоро мы тоже сможем ее применить для редактирования мутаций в крупных генах, которые невозможно доставить целиком, что в итоге сказывается на терапевтической эффективности метода.

Второй большой проблемой редактирования с помощью CRISPR-Cas9 является офф-таргет— эффект, когда Cas-белок вносит разрыв в ДНК не в том месте, где это запланировано, что, в свою очередь, может привести к абсолютно непредсказуемым последствиям, которые тоже останутся в геноме. Вероятность таких событий далеко не нулевая, поскольку здесь мы имеем дело с ферментами, а биологические законы более подвержены влиянию случайных событий, чем законы физики или химии. Таким образом, терапия с помощью CRISPR-Cas9 пока является довольно сырым экспериментальным методом терапии, но имеет самые высокие показатели эффективности, собственно, как и высокие вероятности побочных эффектов.

— В своих экспериментах вы используете альтернативные методики. На чем они основаны и что у них с безопасностью?

— Мы используем заместительную генную терапию на основе аденоассоциированных вирусов, которая позволяет доставить здоровую копию гена с помощью одноцепочечной ДНК и восстановить нормальные функции синтеза белка. Экспериментируем также с доставкой мРНК-транскриптов с помощью наночастиц, которые существенно сокращают путь синтеза белка, поскольку мРНК не нужно проникать в ядро клетки, а сразу можно начинать трансляцию и получать намного больше белкового продукта.

Плюсом этих методик является безопасность и минимальное количество побочных эффектов со стороны иммунной системы. Надо учитывать, что доставка ДНК происходит локализованно в клетки конкретного органа и остается только в клетках, получивших вирус. При этом популяция клеток, получивших препарат, может вытесняться популяцией обычных клеток, и эффект со временем может утратиться — если мы имеем дело с клетками крови или печени, которые постоянно делятся и обновляются в организме.

Поэтому большая часть исследований в области генной терапии с помощью ААВ находит свое применение в терапии наследственных ретинопатий (патологические изменения сосудов сетчатки глаза) и нейродегенеративных заболеваний, поскольку клетки нейронов практически не делятся, а клетки сетчатки делятся максимально медленно. Дополнением служит большое разнообразие генетических причин в виде мутаций в 140 генах, которые обусловливают разные формы наследственной слепоты. Таким образом, глаз как многослойная медленно делящаяся система клеток, изолированных от общего иммунитета, является удобной моделью для разработки сотни разных препаратов генной терапии.

Вылечить «ген слепоты»

— На каком этапе сейчас находится разработка заявленного вашей группой лекарства от наследственной слепоты?

— К настоящему времени по нашему направлению удалось создать четыре прототипа препаратов (два от амавроза Лебера, один от нейропатии зрительного нерва, один от пигментного ретинида). Я разрабатываю препарат от болезни Штаргардта (форма дистрофии сетчатки). Поскольку данный ген большой (шесть килобаз), его приходится делить на две части и доставлять каждую из частей отдельно, а потом собирать в клетке в общее целое с помощью технологии белкового транс-сплайсинга на основе интеинов. Интеины — это группа вспомогательных белков, которая способна автокаталитически соединять крупные белковые молекулы. Данные структуры изначально были обнаружены в одноклеточных грибах и водорослях для сборки крупных полимеразных белков, однако их уникальный аминокислотный состав может быть использован и для любого другого организма. Так, с его помощью можно напрямую собирать крупные терапевтические белки для задач генной терапии, а можно применить эту технологию для сборки инструментальных белков (доставка и сборка прайм-эдиторов, Cre-рекомбиназ), поэтому область приложения у данной технологии довольно широкая, и мы планируем ее и дальше использовать для других задач биотехнологии. На сегодняшний день мы имеем рабочую модель сборки зеленого флуоресцентного белка в клетках человеческих линий эмбриональных почек, пигментного эпителия сетчатки и фибробластов, а также технологию разработки стандартных препаратов генной терапии и разрабатываем технологию с применением интеинов для препаратов, превышающих емкость одного ААВ.

— Что входит в состав вашего генного лекарства, что в итоге «лечит» мутантный фрагмент ДНК?

— Например, в препарате для терапии синдрома Штаргардта, мы амплифицируем ген АВСА4 (специфический белок сетчатки, необходимый для здорового зрения) с суммарной клеточной РНК человеческой линии пигментного эпителия сетчатки глаза и добавляем к ней промоторы (участки молекулы ДНК, к которым присоединяются молекулы РНК-полимеразы, что приводит к транскрипции соответствующих генов), и терминаторы (нетранскрибируемый участок ДНК в конце гена, на котором останавливается синтез РНК), необходимые для экспрессии в клетках человека или бактерий в зависимости от поставленной задачи. Эта комбинация «промотор — ген — терминатор», заключенная в петли вирусного генома, как раз является начинкой нашего препарата.

Суспензия проходит многоступенчатые стадии очистки (downstream), на выходе получается препарат вирусных частиц, очищенный от остаточных клеточных белков и ДНК клетки продуцента. Такой препарат, разведенный в физрастворе, можно использовать как в in vitro, так и в in vivo экспериментах. Суть вирусной доставки проста — распространить максимальное количество генетического материала в клетки организма, однако мы как разработчики можем направлять вирус в нужные нам ткани. Для этого мы используем разные версии вирусных оболочек, покрытые разными антигенами, которые связываются с поверхностными рецепторами клеток и проникают внутрь клеток, инициируя стабильную экспрессию нашего гена и дальнейший синтез белка до тех пор, пока привнесенная клетка не умрет или не поделится. Таким образом, подобная терапия эффективна только на неделящихся клетках организма.

— Если правильно понимаю, вы имплантируете здоровый фрагмент в геном, но при этом не удаляете мутацию. А как будут сосуществовать одновременно оба фрагмента, не будет ли «конфликта интересов»?

— Вспомните школьную биологию. Эволюционно наши организмы наследуют информацию от матери и отца, и так получается два идентичных комплекта почти полностью дублирующейся информации, незначительные отличия в которых определяют наши индивидуальные черты. Эти различия, то есть варианты одного и того же гена, или, по-научному, полиморфизмы, определяют нашу внешность, метаболические особенности и другие индивидуальные параметры. Что происходит, когда в ядре встречаются два идентичных полнофункциональных фрагмента одного гена? Увеличивается количество мРНК-транскриптов, поскольку у клеточной машины намного больше исходного ДНК-материала для транскрипции и дальнейшей трансляции. Это приводит к поддержанию уровня белка на высоком уровне, что чаще всего увеличивает скорость некоторых метаболических процессов. Однократная копия рабочего гена также поддерживает уровень на нормальном уровне, а вот наличие двух неполнофункциональных версий приводит к метаболическим нарушениям (самое легкое проявление — непереносимость некоторых продуктов) или генетическим заболеваниям. Но это то, что касается исходной генетической информации на хромосомах, а приобретенная генетическая информация существует в ядре в виде отдельной структуры — эписомы, с которой идет параллельный синтез мРНК и белка. Если на хромосомах нет нужной информации, то источником является любая другая структура ДНК, присутствующая в ядре. Таким образом, конфликт исчерпан изначально и невозможен в случае рецессивных гомозигот (двух нефункциональных копий на хромосомах).

Если мы свяжем конкретные полиморфизмы с их влиянием на фенотип, соберем выборки в несколько миллионов по каждому этносу и загрузим все данные в мощную нейросеть — будет создан либо самый смертоносный вирус, либо лекарство от всех видов рака

— Какой эффект вы ожидаете получить в ходе экспериментальной терапии? Поможет ли лекарство слепому полностью восстановить зрение и за какое время?

— Наследственные ретинопатии чаще всего первый раз проявляются в возрасте от 30 лет, далее они развиваются по нарастающей вплоть до полной не поддающейся лечению слепоты. В случае применения генотерапевтического препарата их можно замедлить, остановить, при этом частично вернув пациенту зрение. О полном восстановлении мы не говорим, так как эффективность работы биологических препаратов не стопроцентная. Зрительные функции восстанавливается по мере регенерации работы поврежденного компонента цикла фототрансдукции (усиления светового сигнала почти в миллион раз) путем нормализации синтеза недостающего белка, принимающего участие в цепочке реакции. В зависимости от типа заболеваний эффект восстановления проявляется через несколько месяцев.

— Каков круг потенциальных реципиентов такого лечения?

— Это люди, унаследовавшие от обоих родителей одинаковый подавляемый ген с определенной мутацией, так называемые рецессивные гомозиготы по мутантному гену. Частота встречаемости заболеваний варьируется от 1 : 5000 до 1 : 20000 в среднем по миру. Терапия нацелена на пациентов с начальными проявлениями офтальмологических заболеваний, первопричиной которых являются генетические мутации, а триггерами могут быть внешние факторы — например, некоторые формы амовроза Лебера активируются ксенобиотиками, которые попадают в организм с воздухом, пищей, водой. Как правило, в случае синдрома Штаргардта реципиентами будут мужчины в возрасте от 25 до 40 лет без хронических заболеваний. В случае мышечной дистрофии и СМА — дети в возрасте до семи лет. В остальных случаях все индивидуально и зависит от типа наследственных заболеваний и времени манифестации первых симптомов.

Ограничения к применению, как и любых лекарств, у генных препаратов тоже есть. Они обусловлены тем, что любое лекарство влияет на работу печени, почек и селезенки, поскольку любое инородное вещество в избыточной концентрации выводится выделительной системой организма. В случае с применением вирусов самую большую нагрузку берет на себя печень, поэтому у пациентов не должно быть гепатологических заболеваний. Исходя из этого не рекомендуется применять препараты пациентам с патологиями печени, почек, аутоиммунными заболеваниями и другими хроническими заболеваниями метаболической и иммунной систем.

Сложными мы также считаем случаи пациентов с сопутствующими формами сенсорных заболеваний, например с синдромом Ашера (комбинированная слепоглухота с нарушением координации) — здесь генная терапия не является противопоказанием, но препарат придется вводить в несколько органов (глаз и внутренне ухо). Мультифакторные заболевания являются большой проблемой для ученых, генетиков, разработчиков препаратов, врачей и пациентов, но пока однозначного рецепта их лечения наука дать не может.

Расчет дозы лекарств в генной терапии всегда индивидуален — не зря же ее называют персонифицированной. В случае мышечной дистрофии или спинальной мышечной атрофии, которые, как правило, проявляются уже в детском возрасте, расчет производится на каждый килограмм пациента (1Е14 вирусных частиц на килограмм), что со временем кратно увеличивает стоимость терапии, так как с каждым годом вес ребенка увеличивается минимум на два килограмма из-за общего роста организма. Если для терапии ребенка потребуется 15 литров клеточной жидкости, в каждом миллилитре которой содержится один миллион клеток, то для взрослого эта цифра возрастает в четыре-пять раз. Следовательно, для терапии взрослого нам потребуется биореактор емкостью 100 литров, что равно примерно одному триллиону клеток

В случае офтальмологических заболеваний — амаврозы Лебера, атрофии сетчатки — доза на один глаз фиксирована (1Е13 вирусных частиц на глаз) и также зависит от времени проявления симптомов.

Одна доза — миллион долларов

— Сколько в итоге составляет себестоимость генотерапевтических препаратов и за счет чего она может быть снижена?

— Стоимость генотерапевтических препаратов варьируется от 500 тысяч до двух миллионов долларов за одну дозу (офтальмологические препараты), в наших условиях цена одной наработки биореактора объемом 100 литров составляет один миллион рублей, но стоимость одной дозы варьируется от заболевания. В основном цена формируется исходя из количества используемых расходных материалов для культивирования клеток, систем очистки и выделения ААВ и характеризации препарата.

Так дорого это потому, что сборка вируса — процесс случайный. Только два процента от полученной популяции генетического материала является активной и пригодной для терапии. От этого количества еще 20 процентов теряется на очистке, поэтому в реальности мы получаем всего полтора процента от начального количества генетического материала для сборки. Снижение стоимости возможно при использовании платформы наночастиц, но там намного хуже специфичность доставки в ткани. В апреле этого года мы начали работы по исследованию эффективности доставки разными методами, результаты представим в 2027 году.

— Есть ли побочные эффектны у генной терапии и можно ли их контролировать?

— Основное побочное действие препаратов генной терапии, которое наблюдали на заре развития этого направления, — это гепатотоксичность и выраженный иммунный ответ, но стоит отметить, что данный эффект наблюдали на аденовирусах, которые в шесть раз больше ААВ. Аденоассоциированный вирус обладает размером в 20 нанометров и не распознается иммунной системой при первом введении, однако при повторных возможна выработка нейтрализующих антител. Гепатотоксичность также была значительно снижена, но не исключена полностью, но этот вопрос также проявляется, когда речь идет о системном введении препарата внутривенно в больших дозах. В случае офтальмологии болезненным может оказаться введение в стекловидное тело или под сетчатку глаза, поскольку это сложная хирургическая процедура, требующая опыта и специального высокоточного оборудования. Самый безопасный способ введения — неинвазивная форма в виде аэрозоля, но он применим только для генной терапии легких (например, при муковисцидозе), и эффективность таких препаратов пока еще не протестирована. В любом случае побочные эффекты заключаются в исходной проблеме целевой доставки препарата с учетом анатомических, биологических и других составляющих.

У заместительной генной терапии, в отличие от геномного редактирования, побочных действий практически нет или они предсказуемы, если речь не идет о применении некоторых транскрипционных факторов, которые способны вызвать комплексный ответ и со стороны других регуляторных генов, но это уже совсем другая история.

Фантастика через 50 лет

— Есть ли добровольцы для ваших клинических исследований, не боятся ли люди выступать первопроходцами в новых методах лечения?

— Добровольцы есть, но мы пока еще слишком далеки от настоящей терапии на людях. Для полноправного и полноценного применения препарата нам нужно провести еще много тестов на клеточных и мышиных моделях, на кроликах и в идеале на обезьянах. Получение каждой из моделей занимает примерно год, и еще год уходит на тестирование безопасности и стабильности. Потом в рамках нынешнего законодательства препарат необходимо передать на фармпроизводство, где должны оптимизировать технологию его получения в больших объемах, и только потом можно будет начинать клинические испытания.

В итоге суммарный срок разработки нового препарата занимает пять лет в лаборатории и еще пять лет в клинике. Основной проблемой клинических испытаний является небольшая когорта пациентов (в лучшем случае десять тысяч человек, в худшем — пять тысяч человек на всю нашу страну) и сложности реализации третьей фазы клинических испытаний. Поэтому общая тенденция разработки подобных препаратов в мире указывает на то, что после всех стадий клинических испытаний из сотни препаратов одобряется только один или два. Поэтому мы видим такой медленный темп появления новых препаратов — раз в два года.

— Работаете ли вы, тем не менее, с «генетическими ножницами» CRISPR-Cas9? Насколько доступна эта технология для освоения?

— Мы планируем освоить технологию прайм-эдиторов через год. Плазмиды, то есть способные к репликации молекулы ДНК, уже получили, теперь необходимо освоить сложный дизайн гидовых РНК, изучить влияние офф-таргет-эффекта и эффективность редактирования. С нами в команде уже работает коллега — специалист по редактированию, которая помогла нам сделать нокаутную линию мышиных фибробластов для in vitro тестирования препарата от дистрофии Дюшенна. Модель получилась отличная, с ее помощью мы разработали несколько методик функциональных клеточных тестов, которыми на самом деле чаще всего в разработке пренебрегают и сразу переходят к испытаниям на животных. Мы в этом случае делаем довольно уникальные вещи, которые не требуют таких затратных вложений, но позволяют однозначно получить ответ о качестве и эффективности препарата.

— Одна из самых острых вопросов в современной генетике — возможность создания так называемых дизайнерских людей. Насколько мы технически далеки от этого — умения редактировать пары оснований, отвечающие за любые «особенности» человека?

— «Дизайнерские» люди — это фантастическая идея, взятая из фильма Гаттака, которая основана на евгенистических идеях западного общества. Технически редактирование генома людей возможно и было, как мы уже обсудили, реализовано представителем восточного общества китайским ученым Хэ Цзянькуем. Однако в данном случае все упирается в возможность точно связать конкретные полиморфизмы с их влиянием на фенотип, так как, чтобы получить достоверную информацию по этому вопросу, необходима выборка в несколько миллионов человек каждой из существующих этнических групп, возрастов, всех возможных вариантов самых распространенных фенотипов и так далее. Как только мы соберем эти данные и загрузим их в самую мощную нейросеть, то, скорее всего, она разработает или самый смертоносный вирус для человечества, или лекарство от всех видов рака. Но, скорее всего, в ближайшие пятьдесят лет такого не произойдет, поэтому оставим этот вопрос для будущих поколений.