Поскольку ПЦР способна амплифицировать определенный фрагмент ДНК, она используется в патогенной диагностике. С увеличением объема данных секвенирования стало возможным в буквальном смысле слова проектировать кПЦР-анализы для каждого интересующего микроорганизма (группы и подгруппы микроорганизмов и т.д.). Основные преимущества ПЦР в режиме реального времени заключаются в обеспечении быстрого и высокопроизводительного обнаружения и количественного определения целевых последовательностей ДНК в различных матрицах. Меньшее время амплификации облегчается одновременной амплификацией и визуализацией вновь образующихся ампликонов ДНК. Кроме того, кПЦР более безопасна с точки зрения предотвращения перекрестных загрязнений, так как после амплификации не требуется дальнейших манипуляций с образцами. К другим преимуществам метода относится широкий динамический диапазон для количественного определения и мультиплексирование амплификации нескольких мишеней в одну реакцию. Вариант мультиплексирования важен для обнаружения и количественного определения в диагностических анализах, основанных на включении контроля внутреннего усиления. Методики выполняются на оборудования для real-time ПЦР, например на QuantStudio 5 производства Thermo Fisher Scientific
Анализы ПЦР в режиме реального времени используются не только для обнаружения, но и для определения наличия специфических генов и аллелей, например, для типизации штаммов и изолятов, профилирования устойчивости к противомикробным препаратам, производства токсинов и т.д. Однако простое присутствие генов, ответственных за устойчивость к противомикробным соединениям или производство грибковых токсинов, не означает их автоматической экспрессии. Поэтому, несмотря на то, что типизация на основе кПЦР происходит быстрее, ее результаты должны быть соотнесены с фенотипическими и биохимическими тестами.
ПЦР в режиме реального времени играет важную роль в обнаружении, количественном определении и типизации вирусных патогенов. Это связано с тем, что обнаружение важных клинических и ветеринарных вирусов с помощью методов культивирования занимает много времени или невозможно, в то время как тесты ИФА не являются общедоступными и имеют сравнительно низкую чувствительность и специфичность. Метод кПЦР (с включением обратной транскрипции для диагностики РНК-вирусов) обеспечивает соответствующую чувствительность и специфичность. Кроме того, определение вирусной нагрузки по используется в качестве индикатора ответа на противовирусную терапию. По этим причинам метод стал незаменимым инструментом в диагностике вирусов.
Аналогичная ситуация наблюдается и в случае диагностики простейших кишечника. Метод "золотого стандарта" для обнаружения простейших, микроскопического исследования кала, является трудоемким и требует наличия специально обученного персонала. Аналогичным образом, тестирование с помощью ИФА страдает от низкой чувствительности и специфичности. Поэтому в настоящее время полимеразная цепная реакция становится мощным инструментом в рутинном обнаружении, количественном определении и типизации кишечных паразитарных простейших.
В отличие от обнаружения и количественного определения вирусов и простейших, многие бактерии, имеющие клиническое, ветеринарное и пищевое значение, могут быть культивированы. По этой причине культура считается золотым стандартом в обнаружении и количественном определении бактерий. Однако в случаях, когда требуется критическое и своевременное вмешательство в случае инфекционных заболеваний, традиционные, медленные и многоступенчатые методы выращивания культур не могут дать результатов в разумные сроки. Это ограничение усугубляется необходимостью культивирования патогенов и дополнительного тестирования (определение видов, идентификация факторов вирулентности и антимикробной устойчивости). кПЦР способна предоставить необходимую информацию в течение короткого времени; однако фенотипические и биохимические особенности должны быть подтверждены с помощью изолятов бактерий.
В области безопасности пищевых продуктов все международные стандарты качества основаны на определении патогенных микроорганизмов с помощью традиционных методов культуры. Методы ПЦР в реальном времени представляют собой прекрасную альтернативу существующим стандартным методам культур клеток, так как они позволяют надежно выявлять и количественно определять (для нескольких патогенов), а также обладают многими другими преимуществами, о которых говорилось выше. Однако существуют ограничения в отношении чувствительности анализов на основе кПЦР. Поскольку методы культивирования основываются на размножении бактерий на этапе, предшествующем культивированию (предварительному обогащению), образцы для выделения ДНК обычно изначально содержат очень малое количество целевых бактерий. Это ограничение приводит к наиболее важному недостатку метода, который заключается в присущей ему неспособности различать живые и мертвые клетки. Поэтому использование кПЦР само по себе ограничивается типизацией штаммов бактерий, идентификацией устойчивости к противомикробным препаратам, обнаружением и, возможно, количественной оценкой в необработанных и сырых продуктах питания. Важно отметить, что обработанная пища все еще может содержать амплифицируемые ДНК, даже если все потенциально патогенные бактерии в девитализированы, а пищевые продукты микробиологически безопасны для потребления. Для решения этой проблемы перед проведением ПЦР можно поместить предварительно обогащенный образец в культуральную среду. Этот этап может включать неизбирательное обогащение в буферизованной пептоновой воде или специфической селективной среде для соответствующей бактерии. Эта процедура в первую очередь предназначена для реанимации/восстановления и последующего размножения бактерий для последующего обнаружения методом кПЦР; второе преимущество - разбавление и устранение возможных ингибиторов полимеразной цепной реакции, присутствующих в образце (присутствие солей, консервирующих веществ и т.д.). Извлечь ДНК из культуральной среды легче, чем из пищевых образцов, которые по составу гораздо более неоднородны.
Метод ПЦР в режиме реального времени представляет собой мощный инструмент в микробиологической диагностике. При обнаружении вирусов и паразитов, количественном определении и типизации пригодность этой методики не вызывает сомнений; в области бактериальной диагностики она может заменить методы культуральной диагностики, особенно в тех случаях, когда требуются быстрые и чувствительные диагностические анализы. Распространение метода на различные области рутинной микробной диагностики наряду с отсутствием стандартных процедур определения основных функциональных параметров ПЦР в режиме реального времени привело к возникновению сценария, при котором стандартизация методов осуществляется по разным правилам разными лабораториями. Этот вопрос был частично решен публикацией руководства MIQE, однако существуют различия в отношении к валидации и стандартизации анализов в клинической, ветеринарной и пищевой областях безопасности. Любой вклад в унификацию процедур стандартизации и валидации повысит качество анализов в области обнаружения, количественного определения и типизации микроорганизмов.
Каталог оборудования и расходных материалов для ПЦР в режиме реального времени представлен на сайте www.laboratorii.com
